Laboratorio No.9

TÉCNICAS BÁSICAS DE MICROBIOLOGÍA-III

ELABORACIÓN DE UN ANTIBIOGRAMA

 

OBJETIVOS

o Determinar la sensibilidad a diversos antibióticos de un determinado microorganismo

o Comprender el concepto de antibiótico y su especificidad de acción sobre determinadas bacterias.

o Conocer el concepto de cepa sensible y resistente.

o Entender el concepto de halo de inhibición.

o Ser consciente de la importancia de la higiene y el cuidado en la manipulación de materiales biológicos.

o Comprender la importancia de la eliminación de los residuos orgánicos

o Conocer el instrumental de laboratorio necesario en microbiología y los procedimientos para su utilización

MATERIALES

o Jeringa con suero fisiológico estéril (solución de Nacl al 0,9%)

o Placa “problema” (cultivada en agar-sangre) S. aueaus)

o Discos de diferentes tipos de antibióticos (4-6 tipos distintos)

o Tubos de ensayo

o Placa agar-sangre

o Regla milimetrada

o Rotulador de vidrio

o Cinta adhesiva

o Pinzas finas

o Contenedor con lejía

o Torunda estéril

o Tablas para determinación de resistencias

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

Antes de empezar

o No se puede tocar nada que vaya a tomar contacto con la muestra biológica con las manos (depresor, asa de siembre, torunda,) para evitar contaminaciones.

o Una vez utilizado este material ha de ser eliminado en un contenedor especial. Estos contenedores serán llevados posteriormente a una planta de tratamiento de residuos biológicos, donde serán incinerados.

o Todos los materiales o muestras tomadas deben estar perfectamente identificados: nombre, grupo, fecha e indicativo del tipo de muestra.

o Las placas sembradas deben sellarse con cinta adhesiva al finalizar para evitar su contaminación o la nuestra.

o Al acabar la práctica, se deben lavar bien las manos.

Siembra en césped del microorganismo problema 

o Tomamos con una jeringa una pequeña cantidad de suero fisiológico estéril (2-5 ml) y lo vertemos en un tubo de ensayo.

o A partir de la placa problema, que contiene colonias del microorganismo cuya sensibilidad a los antibióticos queremos determinar, tomamos una muestra SUPERFICIAL de UNA SOLA COLONIA con un asa de siembra.

o Introducimos el asa de siembra con la muestra en el tubo y agitamos el asa para realizar una suspensión de las bacterias en el suero fisiológico.

o Introducimos un hisopo estéril en el tubo, mojar el hisopo estéril en la suspensión. Escurrir el exceso de líquido contra las paredes del tubo de ensayo. Tapar el tubo e inocular la placa pasando muy suavemente por la superficie de la placa agar-sangre nueva. En esta ocasión realizaremos una siembra en césped, es decir, por toda la superficie de la placa, para conseguir que crezca bacterias de modo masivo (no interesa aislar bacterias como en la práctica del frotis faríngeo). Es importante que la siembra sea SUPERFICIAL, sin profundizar en el medio de cultivo.  (se puede Inocular dos veces más en ángulos de 60°)

o Se tapa la placa y se rotula indicando en el nombre, grupo y fecha y marcando con una A la tapa (antibiograma) 

Colocación de los discos de antibiótico 

Tomamos ahora con las pinzas –NUNCA CON LAS MANOS- un disco de cada uno de los antibióticos que se facilitan (cada disco es un papel de filtro que contiene una suspensión de uno o varios antibióticos a la concentración terapéutica).

Se deposita el disco suavemente sobre la placa, sin tocar con la superficie con las pinzas. Es muy importante que el disco contacte con el medio de cultivo en un único sitio.

Realizamos la misma operación con los otros cinco antibióticos, colocando los nuevos discos separados de los anteriores, formando un hexágono. 

Se llevan las placas a incubar a 37ºC (temperatura corporal), durante 24 horas. Tras este período se recogen las placas y SIN ABRIR se observa el crecimiento bacteriano.

Medición del halo de inhibición

Por la parte trasera de la placa incubada mediremos el diámetro de los halos de inhibición que se han formado alrededor de los discos de antibiótico a los que la bacteria “problema” es sensible.

Anota los datos en la representación de la figura 2, indicando con un número del 1 al 6, el antibiótico colocado en el disco y dibujando la presencia o ausencia de halos y su tamaño en mm.

 

Incognito

Disco	Antibiótico	Tamaño del halo de inhibición (mm)	Sensible (S)	Resistente (R)
1	Ampicilina	3.5 cm	S
2	Tetraciclina	2.0 cm	S
3	Eritromicina	2.3 cm	S
4	Sulfametaxazol	3.0 cm	S
5	Gentamicina	……..		R
6	Ceftacidina	3.0 cm	S

 

B. Ceresus

Disco	Antibiótico	Tamaño del halo de inhibición (mm)	Sensible (S)	Resistente (R)
1	Ampicilina	2.0 cm	S	R
2	Tetraciclina	2.0 cm	S
3	Eritromicina	………		R
4	Sulfametaxazol	3.3 cm	S
5	Gentamicina	2.5 cm	S
6	Ceftacidina	3.6 cm	S

Aereus

Disco	Antibiótico	Tamaño del halo de inhibición (mm)	Sensible (S)	Resistente (R)
1	Ampicilina	2.5cm	S
2	Tetraciclina	2.0 cm		R
3	Eritromicina	2.8 cm	S
4	Sulfametaxazol	……...		R
5	Gentamicina	2.8 cm	S
6	Ceftacidina	2.8 cm	S

Con ayuda de las tablas que se te proporcionan determina si la bacteria es sensible (S) o resistente (R) a cada antibiótico y anótalo en la tabla, en las columnas correspondientes. 

CONCLUSIONES 

Mediante un antibiograma podemos establecer qué tratamiento será el más adecuado para el paciente afectado por una infección por la bacteria que estemos estudiando.

¿Qué son los halos de inhibición? Alrededor de cada disco de antibiótico, las bacterias sensibles a ese antibiótico no habrán podido reproducirse y, por lo tanto, no forman colonias, dejando un hueco alrededor del disco.

¿Por qué se miden los halos? No basta con ver si las bacterias han crecido o no alrededor del antibiótico para saber si son o no sensibles. Hay que saber “cuánto” no han crecido. Solo si el halo de inhibición es suficientemente grande, usando el antibiótico a la concentración terapéutica –la que el antibiótico puede alcanzar en el lugar de la infección sin que se produzcan efectos tóxicos o secundarios- se dice que la bacteria es sensible al antibiótico. Por eso se mide el efecto y se consultan las tablas.

Responde a las siguientes preguntas:

1. Los antibióticos son sustancias de origen natural, producidas por bacterias y hongos, que impiden el crecimiento o la reproducción bacteriana. ¿Es útil emplear antibióticos contra la gripe? ¿Por qué?

      No, porque los virus son los que causante de esta enfermedad, y no se pueden curan con antibióticos, ya que este solo se utiliza contra las bacterias.

2. ¿Qué es y qué indica la presencia de un halo de inhibición?

      El Halo de Inhibición es aquel que indica la sensibilidad del microorganismo ante al antibiótico.

3. En nuestro intestino grueso existen bacterias: es lo que se conoce como flora intestinal. ¿Por qué son beneficiosas estas bacterias para nuestro organismo?

      son bacterias que tienen como función defender al intestino de posibles infecciones y ayudan a digerir alimentos para formar elementos nutritivos en nuestro organismo.

4. ¿Qué ocurriría si empleáramos un antibiótico de amplio espectro –es decir, que actúa contra un conjunto muy variado de bacterias- teniendo en cuenta lo contestado en la pregunta anterior?

      Normalmente los antibióticos contribuyen al desequilibrio de nuestra flora intestinal, ocasionando estreñimiento, diarrea, infecciones, cansancio o un debilitamiento general en el sistema inmunitario.

5. Uno de los problemas sanitarios más graves en la actualidad es la aparición de cepas bacterianas resistentes a los antibióticos existentes. Se ha culpado de esto a la gran capacidad de mutación de las bacterias y a la costumbre de no terminar los tratamientos con antibióticos (5 días, generalmente) y suspenderlos cuando se nota cierta mejoría. ¿Podrías explicar por qué esta conducta puede provocar la aparición de resistencias?

      La acción antibiótica es una presión ambiental: aquellas bacterias que tengan una mutación que les permita sobrevivir se reproducirán. Ellas pasaran este rasgo a su descendencia, que será una generación totalmente resistente.

Antibiograma:

Consiste en el estudio de la sensibilidad o resistencia de determinado microorganismo (o grupo de ellos) a varios antibióticos. Se puede utilizar para tratar un patógeno, añadir a alimentos, en definitiva, para saber cómo se comporta un germen frente a determinado antibiótico.

El antibiograma se puede hacer tanto en medio líquido como en medio sólido. En nuestro caso vamos a utilizar un agar ordinario pero modificado de manera que gérmenes y antibióticos puedan difundir correctamente: agar de Muëller-Hinton.

Actividad antibiótica por crecimiento en césped. 

Se siembra la cepa de interés en la superficie de una placa de medio Mueller Hinton, realizando la extensión con ayuda de un hisopo estéril (o asa de siembra) de forma que se obtenga un crecimiento confluente o en césped distribuido homogéneamente.

Con ayuda de unas pinzas metálicas (esterilizadas mediante flameado con alcohol), se depositan los discos de los distintos antibióticos sobre la superficie.