AISLAMIENTO DE BACTERIAS
MEDIANTE EL METODO SIEMBRA EN PLACA POR ESTRÍAS
OBJETIVO:
Demostración de los medios de defensa del huésped
en la piel y garganta mediante el método de siembra en placa por estría.
MATERIAL
MATERIAL BIOLÓGICO
Cajas de
petri con Agar- Sangre (GS) Exudado
faríngeo
Cajas de
petri con Manitol sal Agar (MSA)
Caja de
petri con Mconkey (Mcc)
Solución salina estéril
Cajas de
petri con Agar vogel y Jonson (AVJ) Raspado de piel
Cajas de
petri con Agar Estafilococo S110
Mechero Fisher
Asa de platino
Hisopos estériles
INTRODUCCIÓN
La
piel (en condiciones normales) es una barrera que impide la penetración de los
gérmenes, por ello actúa como mecanismo de defensa. Los mamíferos son
frecuentemente infectados por algunas de las bacterias preexistentes en su
medio ambiente, aunque en general viven en equilibrio con estos
microorganismos, manteniéndoles limitados a zonas relativamente superficiales
de su organismo. Sin embargo, las bacterias infecciosas producen enfermedades
al invadir tejidos más profundos. Por lo tanto, para mantener la salud, el
huésped debe defenderse constantemente frente a la invasión por parte de las
bacterias.
Los
factores mecánicos, químicos y microbianos desempeñan un papel importante al
restringir la colonización de las bacterias a las superficies corporales.
Factores
mecánicos: Las superficies epiteliales de la piel y de las mucosas constituyen
barreras que resultan más o menos impermeables a las bacterias. La impermeabilidad
de la piel es mayor que en la mayoría de las mucosas. Cuando se altera la
integridad de la superficie epitelial, pueden desarrollarse infecciones
subcutáneas. Las bacterias que causan más frecuentemente estas infecciones son
las que existen habitualmente en la superficie cutánea, folículos pilosos y
glándulas sudoríparas en la piel, es decir los estafilococos.
Factores
químicos: La acidez de las secreciones gástricas mantienen sin duda la esterilidad
habitual del estómago. El PH bajo de la piel (3-5), debido en gran parte a los
productos ácidos del metabolismo bacteriano, frena sin duda el crecimiento de
muchos microorganismos que toman contacto con su superficie.
Factores
microbianos: El antagonismo microbiano inhibe el crecimiento de
muchas bacterias y hongos potencial mente patógenos en lugares superficiales
donde de no ser así, podrían producirse enfermedades.
La flora de la región faríngea presenta problemas peculiares para el
aislamiento e identificación de microorganismos, por lo tanto, se refiere a los
componentes de la flora normal como a microorganismos con acción patógena. Es
importante recordar que algunos microorganismos tienen capacidad patógena
definida y su presencia es un indicio claro de enfermedades, en tanto que otros,
llamados oportunistas, guardan una posición
ambigua y pueden encontrarse tanto como componentes de la flora normal,
como asociados a procesos patológicos, causados por otros microorganismos que
son verdaderos responsables (por ejemplo los virus) Los estafilococos están entre las primeras
bacterias que se reconocieron como patógenas, y se descubrieron por primera vez
a principios de la década de1880.
Se
encuentran ampliamente distribuidos por la naturaleza, y a menudo forman parte
de la flora bacteriana de la piel y el tracto respiratorio superior; muchas de
las especies que se encuentran en el hombre son comensales. La especie
predominante patógena para el hombre es el staphylococcus aureus,
constituye la causa más común de las infecciones supurativas para el hombre. El
aislamiento de S. aureus a partir del exudado faríngeo y exudado de piel, no
tiene importancia diagnóstica, ya que se considera parte de la flora normal de
la faringe y nasofaringe, por lo que no tiene significado clínico.
PROCEDIMIENTO:
A) Raspado de piel
1.- Limpiar y esterilizar el área a trabajar con
fenol al 5%
2.- Prender el mechero Fischer cerca de donde se va
a trabajar, si es posible colocar otro
3.- Humedecer el hisopo en solución salina estéril,
pasarlo sobre la superficie de la piel (con o sin pelo)
4.- Descargar el hisopo en dos cajas de Petri con
el medio ya preparado. (Es recomendable que para cada dos cajas se utilice un
solo hisopo con muestra). No retires completamente las tapas de los medios de
cultivo para evitar que se contaminen
5.- quemar el hisopo y tirarlo.
6.- Esteriliza el Asa de platino hasta el rojo
vivo, enfríalo introduciéndolo en un extremo del Agar
7.- Realiza el sembrado de los microorganismos por
el método de estría utilizando el asa y como se muestra en la figura. Evita
destapar completamente la tapa de los medios de cultivo.
8- Repetir el mismo proceso con otro hisopo estéril
y con solución salina para otras dos cajas. siembra por estría utilizando el
Asa de platino y así hasta que se terminen de sembrar todos los medios
preparados.
9.- Incubar a 37ºC por 24-48 horas y observar
resultados.
10.- Repite el mismo procedimiento, pero ahora toma
muestra de la faringe con hisopos estériles en las zonas afectadas como:
amígdalas, pared posterior de la faringe, en general cualquier área que
manifiesta signos de inflamación, exudados y úlceras, procurando no tocar con
el hisopo la lengua.
B.
CULTIVO DE BACTERIAS A PARTIR DE UN FROTIS FARÍNGEO
OBJETIVOS
o
Comprender el concepto de colonia bacteriana, medio de cultivo y halo de
inhibición
o
Conocer las técnicas de siembra y cultivo de bacterias
o
Ser consciente de la importancia de la higiene y el cuidado en la manipulación
de materiales biológicos.
o
Comprender la importancia de la eliminación de los residuos orgánicos
o
Conocer el instrumental de laboratorio necesario en microbiología y los
procedimientos para su utilización
MATERIALES
·
Depresor de lengua
·
Torunda o hisopo estéril
·
Placas de agar-sangre
·
Asa de siembra
·
Rotulador de vidrio
·
Cinta adhesiva
·
Contenedor de residuos orgánicos
DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
Antes de empezar
o
No se puede tocar nada que vaya a tomar contacto con la muestra biológica con
las manos (depresor, asa de siembre, torunda,) para evitar contaminaciones.
o Una
vez utilizado este material ha de ser eliminado en un contenedor especial.
Estos contenedores serán llevados posteriormente a una planta de tratamiento de
residuos biológicos, donde serán incinerados.
o
Todos los materiales o muestras tomadas deben estar perfectamente
identificados: nombre, grupo, fecha e indicativo del tipo de muestra.
o
Las placas sembradas deben sellarse con cinta adhesiva al finalizar para evitar
su contaminación o la nuestra.
o
Al acabar la práctica, se deben lavar bien las manos.
Toma de la muestra
o
Se abre con cuidado, por un extremo, el depresor de madera, sin tocar el
otro extremo para mantenerlo estéril.
o
Distribuidos por parejas, uno de los miembros de la pareja sujeta con el
depresor la lengua del otro, colocándola pegada al suelo de la boca,
manteniendo despejada la abertura bucal.
o CON
CUIDADO, se introduce una torunda y se tocan suavemente las amígdalas, en
donde se encuentran bacterias, intentando evitar el contacto con la lengua u
otras zonas. Es normal que se provoque un reflejo de arcada. En este caso, se
separa la torunda y se vuelve a intentar.
o
Al finalizar, se tira el depresor al contenedor de desechos orgánicos.
o Se
tapa la torunda y se rotula con el nombre del donante y la fecha,
indicando con una F, que se trata de un frotis faríngeo.
Siembra A continuación se toma una placa de agar-sangre y se procede a la
siembra del material recogido con la torunda o Hisopo. Se extrae la funda de la
torunda y se pasa SUAVEMENTE por la superficie, cubriendo el área
señalada en el dibujo como (A) Al finalizar, se tira el hisopo al contenedor
de desechos orgánicos.
Aislamiento
Para
intentar que las colonias crezcan separadas tomamos un
asa de siembra y se realizan resiembras en dos zonas:
(B) Tocando con el asa la zona (A) se
realiza una línea zig-zagueante SUAVEMENTE
sobre la superficie (no hay que perforar
la superficie del agar-sangre)
(C) Sin tocar las anteriores zonas.
Se tapa y se sella la placa con cinta
adhesiva.
o
Se rotula la tapa indicando el nombre del donante, su grupo-clase,
la fecha y la F (de frotis faríngeo).
Incubación
y observación
Se
llevan las placas a incubar a 37ºC (temperatura corporal), durante 24 horas.
Tras este período se recogen las placas y SIN ABRIR se observa el crecimiento
bacteriano.
Al
finalizar la práctica se entregan las placas al profesor para que sean
destruidas junto con el resto de material empleado.
OBSERVACIÓN
El medio de cultivo agar-sangre es un medio nutritivo
general, no selectivo, en el cual pueden crecer casi todos los tipos de
microorganismos. Su nombre deriva de que contiene un 5-10% de sangre
desfibrinada (no coagula) extraída de caballo, conejo o, sobre todo, de
carnero.
Las bacterias existentes en la faringe pueden ser de
dos tipos:
o
Flora bacteriana propia o normal, de vida saprofita (crecen sobre restos de
comida).
o
Flora patógena, que provoca enfermedades (especialmente Streptococcus
pyogenes, responsable de la faringitis aguda, la fiebre reumática, angina
estreptocócica, escarlatina, erisipela)
Al
tomar una muestra de la faringe, las bacterias existentes empiezan a dividirse.
De una bacteria se forman miles o millones, dando lugar a una colonia, visible
a simple vista. Todas las bacterias de una colonia son genéticamente idénticas
a la bacteria que las originó e iguales entre sí.
Las resiembras tienen por objetos intentar conseguir
que se formen colonias aisladas de la masa principal.
Al contener el medio de cultivo glóbulos rojos (agar-sangre)
si existiera algún microorganismo patógeno se produciría la destrucción de
estos glóbulos rojos, ya que estas bacterias tienen enzimas que rompen las
paredes de los glóbulos rojos, y se formaría un halo de hemólisis:
alrededor de la colonia de bacterias patógenas se forma una zona transparente.
Así se detecta su presencia en la faringe.
INTERPRETACIÓN
DE RESULTADOS:
A) REACCIONES
POSITIVAS EN DISTINTOS MEDIOS
GELOSA SANGRE
Para el aislamiento, cultivo y detección de
actividad hemolítica de Staphylococcus, Streptococcus y otros microorganismos
fastidiosos. Se observan colonias blancas casi grises, Grandes, convexas de
consistencia butirácea, Presentan bordes regulares. Se observa que Presenta
hemólisis. Las colonias en medio sólido
son redondeadas, uniformes, Estos crecen rápidamente a 37°C, pero tienden a
formar pigmentos mejor a temperatura ambiente (20°C).
MANITOL SAL AGAR
(MSA)
Se utiliza como medio selectivo, para cultivar y
enumerar especies clínicas de estafilococos El manitol cuando es utilizado por
los microorganismos, vira de su color original rojo a amarillo. Se observan colonias chicas, blancas,
convexas, de consistencia butirácea, presentan bordes irregulares. S. aureus
Manitol sal Colonia amarilla S. epidermidis Manitol sal Colonia
incolora
AGAR VOGEL Y
JONSON (AVJ)
Para la detección de Staphylococcus aureus
coagulasa-positivo, se observan colonias negras Pequeñas. bordes irregulares
con halo amarillo. Para S. epidermidis y otros Pequeñas, negro-grisáceos, sin halo,
El medio presenta un vire de rojo pálido a amarillo.
ESTAFILOCOCO
S110
S110 Colonias blancas un poco amarillentas, Se
observan colonias chicas, convexas, De consistencia butirácea y bordes
Regulares.
B) DESCRIPCIÓN
DEL TIPO DE COLONIAS OBTENIDAS
Observar las colonias
obtenidas y describirlas teniendo en cuenta las siguientes características:
. FORMA:
puntiforme, circular, rizoide, irregular, filamentosa.
.
TAMAÑO:
grande (más de 3 Mm.),
mediana (2-3 Mm.),
pequeña (1-2 Mm.)
. COLOR. Reportar el color final después de la
incubación
. BORDE:
entero, ondulado, lobulado, filamentoso, ondeado
.
ELEVACIÓN:
plano, elevado, convexo, pulvinado, umbonado
.
SUPERFICIE: suave, brillante, rugosa, plegada, seca,
polvorienta
CUESTIONARIO:
1.- ¿Cuándo los microorganismos pueden causar daño en nuestro organismo?
Los problemas de las infecciones dependen del
tipo de patógeno, el modo como se transfiere, dosis o concentración de
patógenos, persistencia de los microorganismos
y la resistencia de la persona infectada.
La dosis de
infección significa el número de microorganismos que entra en el cuerpo antes
de que se produzca la infección o enfermedad. Esta dosis es muy baja para los
virus y protozoos parásitos. La persistencia de los microorganismos depende del
tiempo viable de los microorganismos cuando no se encuentra en el huésped
humano. Por ejemplo, las bacterias son generalmente menos persistentes mientras
los quistes protozoitos son los más persistentes. Cuando una persona es
infectada los patógenos se multiplican en el huésped, y esto supone un riesgo
de infección o enfermedad. No todas las personas infectadas por patógenos
enferman. Las personas que enferman pueden contagiar y extender la enfermedad
mediante las secreciones.
2.- Qué tipo de bacterias son encontradas con
mayor frecuencia en nuestra piel y que pretenden aislarse en esta práctica?
Los más frecuentes son los Staphylococcus
y los Streptococcus
3.- ¿Qué finalidad tiene humedecer
el hisopo con solución salina estéril?
Para que al
tomar la muestra de la garganta de nuestro compañero no lo contamine con algunas otras bacterias en
el aire y también para que el hisopo este limpio y nos permita realizar la
muestra.
4.-
¿Por qué no es recomendable utilizar el mismo hisopo para descargar en las
cinco cajas de Petri con los medios ya preparados?
Porque si no
habría una revoltura de bacterias, también tomando en cuenta que solamente se prepararon los medios
especialmente para las bacterias en las que son adecuadamente para ellas,
también se tomaría en cuenta la higiene que tendríamos al hacer nuestro
trabajo.
5.- ¿Por qué se recomienda enfriar
el asa de platino en el medio de cultivo ya preparado antes de realiza el
sembrado por estrías de los microorganismos?
Para que el asa
quede estéril completamente y no se deshaga lo que es el agar y se pueda
realizar el cultivo adecuadamente.
6 ¿En
qué consiste el aislamiento por estrías?
Consiste en
cargar el asa con la muestra y hacer estrías paralelas en la cuarta parte de la
superficie de la placa; se quema el asa, se enfría, se gira la placa 90º y se
vuelve a estriar tocando 3 o 4 veces el área sembrada inicialmente y cubriendo
otro cuarto de placa. Por último, sin quemar el asa, se estría el resto de la
superficie sin sembrar.
7.- Después de
haber incubado a 37·C por 48 horas describe las colonias obtenidas en cada
medio de cultivo utilizado
OBSERVACIONES:
Dibuja y colorea todos los resultados obtenidos
después de las 48 horas de haber sido incubados.
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