Laboratorio No.5

TINCIÓN ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTE

OBJETIVO:

           El alumno aplicará las técnicas de coloración de microorganismos ácido-resistentes para diferenciarlos e identificarlos, en base a sus propiedades morfológicas

MATERIAL:

*Un cultivo de 72 horas de mycobacterium. Si es posible se les facilitará un esputo de tuberculoso procesado en autoclave.

* Un cultivo de 24 horas de estreptococos

REACTIVOS

* Fucsina de Ziehl- Neelsen

* Azul de metileno

* Alcohol acidulado

INTRODUCCIÓN

Los microorganismos pertenecientes al género Mycobacterium se caracterizan por tener una pared celular completamente diferente a las restantes bacterias. La pared de las Mycobacterias posee un alto contenido de lípidos que la hace impermeable a los agentes hidrofílicos, por lo tanto, estos microorganismos no se tiñen adecuadamente con los reactivos utilizados en la coloración de Gram y no pueden ser clasificados como Gram positivos o negativos. Las Mycobacterias son teñidas adecuadamente por el método de Ziehl-Neelsen (Tinción Ácido-Rápida o Acid-Fast Stain) que utiliza como solución decolorante una mezcla de etanol y ácido clorhídrico. Son bacilos ácido-alcohol resistentes por lo que la tinción de Zieh1Neelsen es útil para la coloración de estos microorganismos obtenidos de muestras clínicas o de cultivo. Con esta tinción, los bacilos aparecen de color rojo brillante sobre un fondo azul. Los bacilos tuberculosos son difíciles de teñir con la tinción de Gram, y se observan como bacilos Gram positivos con tinción irregular. Estos microorganismos una vez coloreados son resistentes a la decoloración ácido-alcohólica y por eso se denominan Bacilos Ácido Alcohol Resistentes (BAAR).   El género Mycobacterium incluye más de 100 especies que pueden clasificarse en seis grupos desde el punto de vista bacteriológico, pero con fines didácticos se dividen en tres apartados: Complejo tuberculosis. Incluye las especies M. tuberculosis, Mycobacterium bovis (incluida la cepa BCG) y Mycobacterium africanum, productoras todas ellas de tuberculosis. Se incluye también Mycobacterium microti, productor de tuberculosis en rata Complejo lepra. En el que se incluyen las especies M. leprae, productor de la lepra humana, y Mycobacterium lepraemurium, que produce lepra en roedoresel. El Mycobacterium leprae que es un parásito intracelular obligado que se multiplica lentamente en células fagocitarias mononucleares como los histiocitos de la piel y en las células de Shwan de los nervios Otras Micobacterias. Micobacterias no comprendidas en los dos grupos anteriores. Sólo algunas de ellas suelen ser patógenas, otras pueden ser patógenas oportunistas y finalmente otras suelen ser saprofitas. Producen las denominadas micobacteriosis las infecciones producidas por M. avium, M. kansakii, M. fortuitum y M. chelonei son consideradas oportunistas y no tuberculosas

PROCEDIMIENTO

1. Prepara un frotis bacteriano. Haciendo un delgado extendido del material para su estudio y permitir que se seque al aire.
2. Fijar el frotis con calor, evitar que hierva
3. Cubrir la preparación con carbofucsina. o fuscina fenicada
4. Calentar la preparación en un mechero Bunsen durante 5 min. No debe hervir. Si se evapora, se añade más carbofucsina para que no se seque en ningún momento.
5. Lavar con agua el resto de colorante.
6. Decolorar con la mezcla ácido-alcohol.  Hasta que solo permanezca un tenue color rosa.
7. Lavar con agua para que no prosiga la decoloración.
8. Teñir con azul de metileno 1 min.
9. Lavar con agua el resto de colorante.
10. Secar la preparación.
11. Examinar al microscopio. Con objetivo de inmersión por 100 X (aceite)

La tinción es positiva para bacilos rojos contra un fondo azul claro

CUESTIONARIO

1.- ¿Qué Clasificación de bacterias pueden ser encontradas en este tipo de tinción?

En esta tinción es muy limitado el número de géneros de bacterias de ácido-alcohol resistente:

Ø  Mycobacterium

Ø  Nocardia

Ø   

2.- ¿Qué otro nombre recibe la tinción ácido- alcohol- resistente?

La tinción de ácido-alcohol resistente también recibe el nombre de tinción de Ziehl-Neelsen.

3.- ¿Qué coloración se tiñen las bacterias bacilares en la tinción ácido- alcohol- resistente que da como resultado la reacción positiva?

Si la tinción es positiva las bacterias bacilares se tiñen de rojo contra un fondo azul claro.

4.- ¿Qué función tiene el alcohol en la técnica de tinción?

El alcohol tiene como función la decoloración de la pared de las células para que puedan ser clasificadas y conservarlas por más tiempo.

5.- ¿Qué especies de Mycobacterium son los causantes de la tuberculosis?

Mycobacterium tuberculosis

6.- ¿Qué especie de Mycobacterium es el responsable de la lepra?

Mycobacterium leprae

OBSERVACIONES:

Haz un esquema de los pasos que realizaste durante la realización de la práctica, así como el dibujo de las bacterias bacilares observadas en el microscopio.

 

CONCLUSIONES:

La tinción Ácido-alcohol resistente es la propiedad física de algunas bacterias a la resistencia a la decoloración de la fucsina básica (rojo) la cual penetra en la célula por acción del fenol y el calor.

Las bacterias ácido-alcohol resistentes no pueden ser clasificados según la tinción de Gram.