TINCIÓN DE GRAM
OBJETIVO
El alumno aplicará una técnica de
coloración diferencial para la identificación de bacterias Gram positivas y
Gram negativas.
MATERIAL
Asa de platino Cultivos de Escherichia
coli
Microscopio
Cultivo de Staphylococcus aureus
Porta objetos
Cultivo de Cándida albicans
Aceite de inmersión Esputo de
tuberculoso procesado en autoclave
SUSTACIAS
COLORANTES
Colorante violeta cristal de Gram
Solución decolorante alcohol acetona
Safranina de Gram
Yodo de Gram o lugol para Gram
INTRODUCCIÓN
TINCION DE
GRAM.
Tinción
empleada en microbiología
para la visualización de bacterias en muestras
clínicas. También se emplea como primer paso en la diferenciación bacteriana.
El examen con microscopio óptico de preparación con tinción de Gram se emplea
de rutina para determinar la forma de las bacterias. Las formas comunes son
cocos (esféricas), bacilos (alargadas) y formas espiraladas
Las
bacterias pueden diferenciarse con esta tinción en dos grupos. Los
microorganismos Gram. positivos se tiñen de azul, mientras que
aproximadamente un tercio de los cocos, la mitad de los bacilos y todos los
organismos espira lados se tiñen de rojo y se dice que son gramnegativos.
Las
aplicaciones más comunes de la coloración de Gram son las siguientes:
La
presencia de cocos Gram positivos agrupados sugiere estafilococos; en
cadenas sugiere estreptococos; en forma de lanceta a los diplococos
La
presencia de diplococos gramnegativos son características de especies de
Neisseria
Los bacilos
Gram. positivos grandes sugieren especies de Bacillus o clostridium, los
bacilos Gram. positivos pequeños sugieren especies de Listeria o una de las
corineiformes (difteroides)
Los bacilos Gram. negativos son las
bacterias más comunes halladas en los laboratorios clínicos e incluyen a
Enterobacteriaceae, bacilos no fermentados y especies de Haemophilus.
El
valor diagnóstico de esta tinción es variable; normalmente permite una buena
orientación al microbiólogo para seleccionar las técnicas de cultivo más
adecuadas y también tiene valor en orientar hacia un diagnóstico etiológico, en
especial para instaurar un tratamiento inicial.
PROCEDIMIENTO
REALIZACIÓN DEL FROTIS
- Colocar una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mínima gota de agua, que resulta suficiente.
- Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones asépticas, una pequeña cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensión homogénea que quede bastante extendida para facilitar su secado. Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensión bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos.
- Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando la porta a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaución de no calentar demasiado la porta pues las células pueden deformarse o romperse.
A)
TINCIÓN DE GRAM
- Realiza la preparación del frotis bacteriano como se explicó en el paso anterior
- Teñir con cristal violeta 3 min.
- Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
- Cubrir con Lugol 1min.
- Lavar con agua el exceso de Lugol.
- Decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la preparación deje de perder color (30seg)
- Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente.
- Teñir con safranina 2 min.
- Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste.
- Secar la preparación.
- Examinar al microscopio con aceite de inmersión y fijándose sobre todo en el color de cada preparación.
CUESTIONARIO
1.- ¿Qué es un
frotis?
Un frotis es un
mecanismo científico que consiste en el extendido de una gota en la superficie
de un portaobjetos o de un cubreobjetos, con el fin de analizarla posteriormente.
2.- ¿Con qué
finalidad se fija la muestra de microorganismos en la porta objetos?
Se fija el
frotis por calor o por agentes químicos. Con las siguientes finalidades:
Se evita la deformación de las células con el colorante.
Para posicionar las estructuras internas y externas de la célula
Además se mata al microorganismo.
Preserva la morfología general pero no las estructuras internas.
Se evita la deformación de las células con el colorante.
Para posicionar las estructuras internas y externas de la célula
Además se mata al microorganismo.
Preserva la morfología general pero no las estructuras internas.
Protege la
subestructura fina y la morfología de los microorganismos delicados de mayor
tamaño.
3.- ¿Qué
importancia tiene teñir las muestras bacterianas?
La tinción
bacteriana tiene dos propósitos fundamentales:
a) Identificar la bacteria (Gram positiva o Gran negativa).
b) Con base en la identificación, indicar el tratamiento correcto (los antibióticos no funcionan por igual para bacterias Gram positivas que Gram negativas).
Además Tinsionar las bacterias es importante para poder verlas en el microscopio, dependiendo el tipo de bacterias se tinciona de cierta manera siguiendo un protocolo.
a) Identificar la bacteria (Gram positiva o Gran negativa).
b) Con base en la identificación, indicar el tratamiento correcto (los antibióticos no funcionan por igual para bacterias Gram positivas que Gram negativas).
Además Tinsionar las bacterias es importante para poder verlas en el microscopio, dependiendo el tipo de bacterias se tinciona de cierta manera siguiendo un protocolo.
4.- ¿Por qué es
necesario emplear aceite de inmersión para la observación de los
microorganismos?
El aceite de
inmersión tiene aproximadamente el mismo índice de refracción que el vidrio y
con él se elimina casi completamente los rayos de la luz y aumenta en gran
cantidad la eficacia del uso del microscopio.
Al ofrecer un índice de refracción similar al del vidrio, el objeto aparece como "incluido en el vidrio del objetivo" eliminando el efecto reflector del vidrio exterior del. Eso permite lograr mucho mayores aumentos con menor distorsión esférica, menor aberración cromática y mayor luminosidad o "abertura de pupila".
Al ofrecer un índice de refracción similar al del vidrio, el objeto aparece como "incluido en el vidrio del objetivo" eliminando el efecto reflector del vidrio exterior del. Eso permite lograr mucho mayores aumentos con menor distorsión esférica, menor aberración cromática y mayor luminosidad o "abertura de pupila".
5.-De los
reactivos que utilizaste para la tinción de Gram, ¿cuál es el que
violeta cristal
es el que funciona como colorante primario.
6.- ¿Qué
función tiene el Yodo en la tinción de Gram?
El I2 entra
en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal
violeta. El lugol es un compuesto formado por yodo en equilibrio con
yoduro de potasio, el cual está presente para solubilizar el yodo, y actúa de
mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la
pared de la célula bacteriana.
7.- ¿Qué
coloración tiñen las bacterias Gram positivas?
Las Bacterias
Gram positivas. Poseen una pared celular gruesa con numerosas capas de
peptidoglucano, las cuales retienen el colorante cristal violeta. Algunas de
estas bacterias se rodean además de una cápsula o cubierta gruesa y viscosa de
polisacáridos. AZUL
.8.- ¿Qué
coloración tiñen las bacterias Gram? negativas?
Las Bacterias Gram
negativas. Poseen una pared celular fina y una segunda membrana lipídica
denominada membrana externa, la cual no retiene el colorante cristal violeta,
como en Escherichia coli, de ahí que tome una tonalidad de color rosado.
9.- Menciona
tres bacterias que tiñen Gram positivas y escribe la enfermedad que causa cada
una de ellas
Erisipelotricosis:
es una infección cutánea de lento desarrollo causada por la bacteria
Erysipelothrix rhusiopathiae.
A pesar de que la Erysipelothrix rhusiopathiae crece principalmente en un medio con materia muerta o en descomposición, también puede infectar a insectos, moluscos, peces, aves y mamíferos.
- Listeriosis: es una enfermedad causada por Listeria monocitogenes, da lugar a una sintomatología diversa de acuerdo con el lugar en que se produce la infección y la edad de la persona afectada.
La Listeria se encuentra en todo el mundo, tanto en el ambiente como en los intestinos de los pájaros, las arañas, los crustáceos y los mamíferos no humanos.
- Ántrax: es una enfermedad causada por la bacteria Bacillus anthracis, que puede infectar la piel, los pulmones y el aparato gastrointestinal.
El ántrax es una enfermedad muy contagiosa y potencialmente mortal. Por lo general, pasa a las personas a través de algunos animales, en especial las vacas, las cabras y las ovejas.
A pesar de que la Erysipelothrix rhusiopathiae crece principalmente en un medio con materia muerta o en descomposición, también puede infectar a insectos, moluscos, peces, aves y mamíferos.
- Listeriosis: es una enfermedad causada por Listeria monocitogenes, da lugar a una sintomatología diversa de acuerdo con el lugar en que se produce la infección y la edad de la persona afectada.
La Listeria se encuentra en todo el mundo, tanto en el ambiente como en los intestinos de los pájaros, las arañas, los crustáceos y los mamíferos no humanos.
- Ántrax: es una enfermedad causada por la bacteria Bacillus anthracis, que puede infectar la piel, los pulmones y el aparato gastrointestinal.
El ántrax es una enfermedad muy contagiosa y potencialmente mortal. Por lo general, pasa a las personas a través de algunos animales, en especial las vacas, las cabras y las ovejas.
10.- Menciona
tres bacterias que tiñen Gram negativas y escribe la enfermedad que causa cada
una de ellas.
a) Las
Enfermedades Vasculares se caracterizan por la invasión de los haces vasculares
los cuales se llenan de bacterias y producto
de su
metabolismo obstaculizan el flujo de agua y nutrientes a través de toda la
planta, provocando su marchitamiento y muerte. Por ejemplo: Erwinia
trachephila.
b) Las Enfermedades Parenquimáticas, aquí Las bacterias invaden los tejidos suculentos y después de invadir los tejidos vasculares adyacentes provocando tizones, necrosis o manchas foliares. Por ejemplo: Pseudomonas syringae pv. phaseolícola.
c) Las Enfermedades Hiperplásticas, aquí las bacterias invaden cualquier parte de la planta, luego secretan sustancias reguladoras de crecimiento (Auxinas, Giberelinas, etc.), las cuales, debido a su adicción, a la cantidad normal de la planta, causan aumento y división celular normal del tejido afectado, causando excesiva proliferación de tejidos (tumores) y formación de órganos adicionales.
b) Las Enfermedades Parenquimáticas, aquí Las bacterias invaden los tejidos suculentos y después de invadir los tejidos vasculares adyacentes provocando tizones, necrosis o manchas foliares. Por ejemplo: Pseudomonas syringae pv. phaseolícola.
c) Las Enfermedades Hiperplásticas, aquí las bacterias invaden cualquier parte de la planta, luego secretan sustancias reguladoras de crecimiento (Auxinas, Giberelinas, etc.), las cuales, debido a su adicción, a la cantidad normal de la planta, causan aumento y división celular normal del tejido afectado, causando excesiva proliferación de tejidos (tumores) y formación de órganos adicionales.
5.Cuáles son
las fuentes de errores más comunes de error en la tinción de Gram
Los peores obstáculos de la Tinción, que
impiden conseguir el resultado perseguido, son los errores del técnico. Para
evitarlos hay que elegir bien los reactivos y ser muy cuidadosos al ejecutar la
técnica. A continuación, describimos algunas de las fuentes de
error: Impurezas en los reactivos de Tinción.
Concentración inadecuada de los reactivos de
tinción.
pH inadecuado.
El colorante se fija a la célula por mecanismos
físico-químicos, que se alteran si el PH no es el apropiado.
Los colorantes pueden ser ácidos, básicos o
neutros.
Tiempo de Tinción incorrecto.
Temperatura suficiente.
2. Explique qué
reacción de Gram darán las levaduras. Estos tendrán la misma importancia que
para las bacterias.
El color depende de la composición de la
pared celular de la levadura y no tiene tanta importancia como las bacterias ya
que en ellas existe toda una clasificación por medio del Gram lo que
no sucede con las levaduras.
3. Explique el
fundamento de la tinción negativa realizada en la práctica. Qué tipo de
información se obtiene.
La Tinción negativa es el reverso del
procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir, pero se colorea
en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las
células. La Tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el
contraste de las células en la microscopia óptica, pero su máxima utilidad está
en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.
4. Investigue
otra técnica de tinción selectiva que permita observar otras estructuras
bacterianas.
Las Tinciones Selectivas nos permiten observar
estructuras de las células gracias a su mayor afinidad por los
colorantes utilizados.
5. ¿A qué se
debe el distinto comportamiento de las bacterias según sean Gram+ o Gram-?
El distinto comportamiento en
la Tinción se piensa que es debido a las diferentes capas
superficiales o paredes de las dos bacterias (Tipos de Células).
6. ¿Para qué se
necesita el aceite de inmersión?
El aceite de inmersión tiene un índice
de refracción similar al del vidrio (1,5 aprox.) y se utiliza para el
objetivo de 100X.
OBSERVACIONES:
Realiza los dibujos y esquemas correspondientes a las tinciones realizadas
CONCLUSIONES:
La diferencia química es los que
permite distinguir las bacterias por Tinción, el colorante reacciona
con la célula bacteriana, pero no reacciona con su medio exterior.
Debido a eso la Tinción es importante
para la microbiología ya que:
Proporciona contraste entre el microorganismo y el
medio que lo rodea, permitiendo diferenciarlas.
Permite el empleo de mayores amplificaciones.
Muy informativo. Me a ayudado a comprender mas acerca de la tinciÓn
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