Laboratorio No.10

DETERMINACIÓN DEL TIEMPO Y PUNTO TÉRMICO MORTAL EN MICROORGANISMOS

OBJETIVO

          El alumno aplicará un método que le permitirá conocer la temperatura y el tiempo mínimos necesarios para esterilizar una suspensión, así como el efecto que tienen diferentes diluyentes sobre dichas determinaciones.

MATERIAL

Tubos de 13 X 100 estériles-12

Pipetas de 5 ml estériles

Pipetas del ml estériles

Cajas de Agar Nutritivo o Agar sangre 12

Baños maría a 37·C, 70·C, y ebullición

Tubos de ensaye con 1 ml de puré de tomate, jugo de naranja y agua destilada (24)

CEPAS

Escherichia coli

Staphylococcus aureus

Klebsiella Pneumoniae

INTRODUCCIÓN:

  Diferentes   especies microbianas varían ampliamente en sus fluctuaciones de temperatura óptima para su desarrollo: Las llamadas psicrófilas crecen mejor a temperaturas bajas (15 a 20·C), las formas mesófilas lo hacen mejor de 30 a 37·C, la mayor parte de la termófilas entre 50·C y 60·C.

          La mayor parte de los microorganismos son mesófilos, 30·C es la temperatura óptima para muchas de las formas de vida libre y la temperatura del huésped es óptima para los simbiontes de los animales de sangre caliente.

          El límite superior de temperatura tolerada por cualquier especie se correlaciona bien con la estabilidad térmica general de las proteínas de dicha especie.

          Los microorganismos comparten con los vegetales y los animales la respuesta al choque por calor, una síntesis de proteínas por el calor cuando son expuestos a una elevación súbdita en la temperatura por arriba de la óptima para el crecimiento. Al parecer estas proteínas son resistentes al calor y estabilizan a las proteínas de la célula sensible al calor. Las bacterias también exhiben fenómeno denominado choque por frío, ósea la muerte de las células por un enfriamiento rápido, en oposición a uno lento. Por ejemplo, el enfriamiento rápido de la escherichia coli desde 37·C a 5·C puede matar al 90% de las células

EFECTO LETAL DEL CALOR.

 Al subir la temperatura por encima de la temperatura máxima de crecimiento, se dejan sentir los efectos sobre la viabilidad: la pérdida de viabilidad significa que las bacterias dejan de ser capaces de crecer y dividirse. La muerte se debe a la destrucción o inactivación irreversible de una molécula o estructura esencial (como p. ej. el ADN cromosómico o por creación de un daño irreparable en la membrana). ¿Cómo podemos caracterizar o medir en la práctica la inactivación por calor de una suspensión bacteriana? He aquí algunos parámetros utilizados:

	tiempo térmico mortal: es el tiempo mínimo requerido para que mueran todas las bacterias de una determinada suspensión a una determinada temperatura;
	tiempo de reducción decimal: es el tiempo requerido para reducir al 10% la densidad de la suspensión, a una determinada temperatura (también llamado valor D);
	punto térmico mortal: es la temperatura mínima que mata a todas las bacterias en un tiempo determinado (normalmente el tiempo de referencia empleado es de 10 min).

PROCEDIMIENTO

A) PREPARACIÓN DE LAS SUSPENSIONES MICROBIANAS

1.- Adicionar agua destilada a cada cepa que se va a estudiar cuidado de que quede turbia a manera de suspensión.

2.- Colocar 1 ml de jugo de naranja en un tubo de 13 X 100, 1 ml de Agua destilada en otro tubo de 13X100 y 1 ml de puré de tomate en otro tubo de 13 X 100. Será necesario rotularlos.

3.- transferir 1 ml de la suspensión bacteriana preparada a cada tubo.

B) DETERMINACIÓN DEL PUNTO TERMICO MORTAL (PTM)

1.- Colocar en una gradilla una serie de 4 tubos de 13 X 100 para cada tipo de bacteria a estudiar

2.- Marcar cada tubo con el nombre de la cepa que se va a estudiar.

3.- Anotar en cada tubo las temperaturas siguientes   testigo, 37·C, 70·C, y ebullición

4.- Colocar en cada tubo 0.5 ml de la suspensión bacteriana que preparaste con agua, jugo de naranja y puré de tomate a tratar

5.- Calentar la suspensión a la temperatura indicada en un baño maría durante 10 minutos (el tubo testigo NO SERA CALENTADO)

6.- Vaciar el contenido de cada tubo en la superficie de una placa de Agar nutritivo y Homogeneizar por rotación sobre la mesa o mediante extensión con varilla de vidrio doblada a 90 grados

7.- Incubar a 39:C durante 24- 48 horas

8.- Observar si hay crecimiento.

C) DETERMINACIÓN DEL TIEMPO TÉRMICO LETAL(TTL)

1.- Colocar en una gradilla una serie de 4 tubos de 13 X 100 para cada tipo de bacteria a estudiar

2.- Marcar cada tubo con el nombre de la cepa que se va a estudiar

3.- Anotar en cada tubo los tiempos que se indican a continuación: Testigo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos

4.- colocar en cada tubo 0.5 ml de la suspensión bacteriana que preparaste con agua, jugo de naranja y puré de tomate a estudiar

5.- Calentar en baño maría a 70·C para todos los tubos y respetando los tiempos indicados (el tubo testigo NO SE CALIENTA)

6.- Vaciar el contenido de cada tubo sobre la superficie de una placa de Agar nutritivo y homogeneizar por rotación sobre la mesa o extensión con varilla de vidrio doblado a 90 grados

7.- Incubar las placas a 37·C durante 24- 48 horas

8.- Observar si presenta o no crecimiento

 CUESTIONARIO:

1: ¿Qué características presentan las bacterias llamadas psicrófilas?
Las llamadas psicrófilas obligadas tienen temperatura optima a 15-18°C.

Las Psicrófilas Facultativas o psicrotolerantes (también llamadas Psicótropas) presentan temperatura optima en torno a los 20- 30°C y máximas a los 35°C.

2.- ¿A qué temperatura crecen las bacterias mesófilas?

Los mesófilos presentan temperaturas optimas a los 2-40°C y máximas entre 35 y 47°C. La mayor parte de los microorganismos que viven en ambientes templados y tropicales, incluyendo los simbiontes y parásitos, pertenecen a esta categoría.

3.- ¿Qué sucede con las proteínas en la célula bacteriana cuando se aplica un cambio brusco en la temperatura

Cuando la temperatura es elevada aumenta la energía cinética de las moléculas con lo que se desorganiza la envoltura acuosa de las proteínas, y se desnaturalizan. Así como su aumento de la temperatura destruye las interacciones débiles y desorganiza la estructura de la Proteína.

4.- ¿En qué consiste el tiempo térmico letal?

Es el tiempo mínimo requerido para que mueran todas las bacterias de una determinada suspensión a una determinada temperatura.

5.- ¿En qué consiste el punto térmico mortal?

Es la temperatura mínima que mata a todas las bacterias en un tiempo determinado (normalmente el tiempo de referencia empleado es de 10 min.).

6.- ¿A qué temperatura se reporta el punto térmico mortal para las bacterias estudiadas en los distintos diluyentes?

En la Staphylococcus Aureus se tiene un punto térmico mortal de 70° C y de la Klepsiella Pneumoniae es de 100°C

7.- ¿Qué muestras después de la incubación reporta el tiempo óptimo para la destrucción de las bacterias en los distintos diluyentes?

El tiempo óptimo fue de 15 minutos para que hubiera menor crecimiento bacteriano.

RESULTADOS:

Completa las siguientes tablas después del tiempo adecuado y temperatura de incubación para los distintos medios.

A) PUNTO TERMICO MORTAL (PTM)

Cepas	Diluyente	Crecimiento después de calentar
E. coli		Testigo	37 ºC	70ºC	Ebullic.
	Agua-salina
	Jugo de Naranja
	Puré de tomate
S. aureus		Testigo	37 ºC	70ºC	Ebullic.
	Agua-salina
	Jugo de Naranja
	Puré de tomate
K.pneumoniae		Testigo	37 ºC	70ºC	Ebullic.
	Agua-salina
	Jugo de Naranja
	Puré de tomate

B) TIEMPO TÉRMICO LETAL(TTL)

Cepas	Diluyente	Crecimiento después de calentar
E. coli		Testigo	5 min	15min	30 min.
	Agua
	Jugo de Naranja
	Puré de tomate
S. aureus		Testigo	37 ºC	70ºC	Ebullic.
	Agua
	Jugo de Naranja
	Puré de tomate
K. pneumoniae		Testigo	37 ºC	70ºC	Ebullic.
	Agua
	Jugo de Naranja
	Puré de tomate

OBSERVACIONES:

          Dibuja los pasos que seguiste para la realización de la práctica

CONCLUSIONES:

En conclusión, hay bacterias que se exponen a temperaturas altas o bajas lo cual estas las afectas y mueren.

Por ejemplo: La Klepsiella Pneumoniae resisten a las altas temperaturas, mientras que la Staphylococcus aureus solo resisten a temperaturas de 70°C.