Laboratorio No.6

AISLAMIENTO DE 2 MICROORGANISMOS Y OBTENCION DE UN CULTIVO

AXENICO

I.OBJETIVO

Aislar dos microorganismos por la técnica de siembra de dilución por estría en

placa de agar y obtener un cultivo axénico o puro.

II.INTRODUCCION

Si se toma un asa bacteriológica cargada con una muestra que contenga bacterias

y se van haciendo estrías de ésta sobre una placa de agar nutritivo de tal manera

que el material se vaya “diluyendo” sobre la superficie (Fig. 12.1), llegará un

momento en que las bacterias depositadas en la estría estén bien separadas unas

de otras, reproduciéndose cada una en progresión geométrica (1, 2, 4, 8, 16, 32,

64, etc.).

Dependiendo del tiempo de generación, que varía según la especie bacteriana,

después de cierto tiempo, cada una se habrá multiplicado muchas veces,

formando sobre la superficie del medio un pequeño promontorio constituido por

células bacterianas llamado Colonia, que se obtiene generalmente en unas 24-48

horas.

Las colonias de cada especie bacteriana son diferentes ya sea en tamaño, color,

consistencia etc., y pueden ser diferenciadas sobre estas bases.

Cada colonia aislada está constituida de un solo tipo de bacterias, ya que se

supone que es la descendencia de una sola célula y por tanto, un cultivo puro.

Para estudiar las características físicas, químicas, fisiológicas, etc., de una

bacteria, se necesita que ésta sea aislada en cultivo puro y el aislamiento en caja

Petri es el primer paso para ello, siendo el segundo paso la siembra de una

porción de una colonia en un medio de cultivo en tubo, verificando su pureza

después de la incubación apropiada, mediante observación al microscopio.

La morfología de las colonias es importante por lo anteriormente expuesto y debe

familiarizarse el alumno con ella. (Fig. 12.2). La terminología mencionada a

continuación sobre algunas de las características más constantes de una colonia

bacteriana es muy útil:

FORMA:

Puntiforme, circular, irregular, alargada, fusiforme, filamentosa, rizoide, etc.

TAMAÑO: Estimar el diámetro en mm.

SUPERFICIE: Lisa, rugosa, cerebriforme, en anillos concéntricos, etc.

ELEVACION: Aplanada, elevada, pulvinada, convexa, umbonada, umblicada, etc.

BORDE: Continuo, ondulado, lobulado, erosionado, festoneado, filamentoso, etc.

ESTRUCTURA INTERNA: Amorfa o granulosa.

COLOR: Según sea observado por la luz reflejada o por la luz transmitida, puede ser de color blanco, amarillo, rojo ladrillo, anaranjado, etc.

OPACIDAD: Transparente, opaca, etc.

CONSISTENCIA: Dura, viscosa, membranosa, gelatinosa, mucosa, etc. Usar el asa bacteriológica para determinar la consistencia.

III. MATERIAL Y SUBSTANCIAS.

Caja de Petri conteniendo agar nutritivo estéril.

2 Tubos de ensayo conteniendo agar inclinado.

Tubos de ensayo conteniendo cultivo mixto. Tubo 1Tubo2

Lápiz graso.

Asa bacteriológica.

Mechero Bunsen.

Cerillos ó encendedor.

Gradilla.

IV. TECNICA

1. Con el lápiz graso dividir la caja Petri en 3 sectores, de tal manera que al

destaparla para proceder a la inoculación, se tenga como se indica en la figura:

El sector No.

1. es más pequeño y sirve para descargar el asa.

2. Usando la técnica ya conocida, tomar el cultivo bacteriano y en condiciones

asépticas obtener una asada del material.

3. Una vez cerrado el tubo, colocarlo en una gradilla.

4. Con la mano izquierda levantar parcialmente la tapa de la caja de Petri y

descargar el material en el sector 1, trazando una serie de zig-zagsa muy

cerrados a todo lo ancho del sector. Cerrar la caja.

5. Esterilizar el asa flameándola y mientras que se enfría, girar la caja 90° hasta

que el sector 1 quede a la izquierda y el 2 hacia arriba a la derecha.

6. Trazar unos 5 zigzags en el sector 2 invadiendo el sector 1 para llevar un poco

de material al sector 2 y las siguientes estrías no deben tocar el sector 1. En

esta forma se diluye el material quedando unas bacterias separadas de las

otras.

7. Esterilizar de nuevo el asa, girar la caja 90° y ahora el sector 2 estará a la

izquierda y el 3 a la derecha.

8. Trazar unos 5 zigzags en el sector 3 invadiendo el sector 2 y el resto sin tocar

el sector 2, como se muestra en el dibujo:

 

9. Incubar a 37°C por 24-48 horas.

10.Observar si hubo o no, aislamiento de colonias.

 

NOTA:

En el sector 1 generalmente no se obtienen colonias aisladas, pero en 2 y 3 sí.

11.Anotar las características de las colonias aisladas

12.Inocular a partir de las colonias aisladas los tubos de agar inclinado, por estría,

para obtener cultivos puros. (Fig. 12.3)

13.Incubar a 37°C por 24-48 horas.

14.Después de este período observar si efectivamente hubo crecimiento de un

solo tipo de microorganismos.

15.Preparar un frotis, teñir con la técnica de Gram y observar al microscopio con

objetivo de inmersión para confirmar su pureza.

16.Dibujar las observaciones hechas al microscopio

17.Guardar los cultivos puros en el refrigerador para su posterior clasificación e

identificación.

NOTAS:

Siguiendo la misma técnica, la caja de agar se puede dividir en más de 3

sectores, obteniendo una dilución mayor, como se muestra en el dibujo:

 

Existen otras técnicas de aislamiento en placa, como pueden ser la

siembra en superficie y la de placa vertida. (Fig. 12.4)

V. CUESTIONARIO

1. Describir una técnica de aislamiento bacteriano a partir de una fuente natural.

Técnica se aislamiento y recuento. Banco de diluciones: consiste en obtener una suspensión de la mezcla de microorganismos y hacer diluciones seriadas que se vierten en una placa Petri hasta conseguir colonias aisladas.

Estrías escocesas. Se procede de forma similar al caso anterior, en lo que se

respecta al método general para la siembra en placa y permite también obtener colonias aisladas

2. Consultar dos técnicas de aislamiento en tubo.

Ø  Técnica de placa vertida

Esta técnica consiste en hacer la dilución de la muestra en tubos de ensayo con Agar fundido y enfriado. Para hacer las diluciones se

requieren de más de dos tubos, para obtener colonias aisladas. El medio de cultivo se mantiene en estado líquido a 45° C para permitir la mayor

reproducción y distribución de la muestra. Una vez hecha la muestra se coloca en la caja Petri y se incuban. Se procede a aislar bacterias, que es el principal objetivo de esta técnica aislar tipos de bacterias en forma

cuantitativa y cualitativa.

Ø  Técnica de aislamiento en una sola célula

 Para obtener un solo microorganismo, para su estudio se necesita

de equipo especial como el micro manipulador. Este aparato permite al

investigador o científico controlar los movimientos con una sola micro pipeta. Al observando bacterias, si se desea investigar, a una en especial se atrapa a la célula.  Esta técnica se utiliza en estudios especializados con operadores o investigadores especializados.

Ø  Técnica de Enriquecimiento de Cultivo

Esta técnica es crear un tipo de ambiente adecuado para cierta bacteria u otros organismos para su proliferación.

3. ¿Qué es un cultivo axénico o puro?

Un cultivo puro o axénico es aquel que contiene un solo tipo de microorganismo.

En el cultivo axénico es un grupo de bacterias en cultivo, pero sin control, y en el cultivo puro, se lleva un control de reproducción para que se conserve sus características genéticas puras.

4. ¿Qué importancia tiene la obtención de un cultivo puro?

Una vez que se obtiene un cultivo puro, normalmente se ha de propagar (se le hace crecer de nuevo). Para cultivar microorganismos en el laboratorio, se ha de preparar un medio de cultivo, líquido o sólido, con todos los nutrientes necesarios para su crecimiento. Los medios sólidos se hacen generalmente, añadiendo agar a los líquidos

5. Mencionar 5 Colecciones de Cultivos suministradoras de cultivos microbianos

puros.

ü  Medios Sintéticos o Definidos  

ü  Medios Selectivos

ü  Medios Complejos o Indefinidos 

ü  Medios Enriquecidos

ü  Medios Diferenciales