Laboratorio No.4

TINCIONES SELECTIVAS

OBJETIVO

El alumno aplicará la técnica de tinción específica para lograr observar en el microscopio la pared celular y endoesporas en distintas muestras bacteriológicas.

MATERIAL

Cultivo de 12 a 18 horas de Bacillus Suptillus (lacto bacilos) en Agar nutritivo y Agar sangre

Cultivo de Bacillus cereus (tierra contaminada y tratada a 80·C por 10 minutos) en Agar nutritivo y Agar sangre

Cultivo de 24 horas de Staphylococcus aureus en manitol sal Agar (msa)

Solución de ácido fosfomolíbdico (1%)

Solución acuosa de verde de metilo (1%)

Verde malaquita (solución acuosa al 5%)

Safranina (solución acuosa al 5%)

Portaobjetos

Cubreobjetos

Microscopio compuesto

Asa bacteriológica

Mechero Bunsen

INTRODUCCIÓN

PARED CELULAR

          Debajo de las sustancias extracelulares tales como las cápsulas o capas mucosas y externas a la membrana citoplasmática está la pared celular que es una estructura muy rígida y que da forma a la célula. El espesor de la pared celular oscila entre 10 y 35 nm, sin embargo, algunas paredes celulares son considerablemente más gruesas.

          Las paredes celulares bacterianas son esenciales para el crecimiento y la división. Todas las bacterias poseen paredes celulares rígidas que protegen a la célula de explotar en medios de baja presión osmótica.

          Composición química de las paredes celulares. -  Los peptidoglicanos proporcionan a la pared celular una estructura rígida. Estos grandes polímeros, están compuestos de tres clases de bloques estructurales: N- Acetil-Glucosamina, Ácido N- Acetil-Murámico y un péptido que consta de cuatro o cinco aminoácidos que son: L- alanina, D-Alanina, _D-Ácido Glutámico y Lisina. Además, contiene proteínas con polisacáridos, lipoproteínas y lipopolisacáridos

Propiedades y Funciones: 1= Brinda protección y resistencia a la bacteria frente a los posibles cambios de presión osmótica del medio en el que se encuentra y a la acción de ciertos agentes externos.2= Presenta Poros que actúan como filtros, permitiendo el pasaje de agua y metabolitos esenciales.3= Presenta antígenos de tipo y grupo específicos.4= Participa en la división (multiplicación) bacteriana (se invagina junto con la membrana plasmática)5= En las bacterias Gram .negativas tiene poder patógeno debido a que presenta endotoxinas (Lípido A).6= Es el sustrato donde actúan los  - Lactámicos y otros antimicrobianos.

          La tinción para la pared celular se aprovecha del hecho de que los contenidos citoplasmáticos se pueden hidrolizar diferencialmente con ácido fosfomolíbdico, dejando la pared sin afectar. Después de teñir se puede observar la pared celular con citoplasma como ahuecado.

ESPORAS

 

          Son elementos de reproducción y/o de resistencia a un medio adverso que presentan algunas bacterias, especialmente del género bacilar. Su forma, tamaño y ubicación varía según la especie. Estos cuerpos son producidos en el último estadio del crecimiento celular, que, bajo condiciones apropiadas, germinan y producen la clase original de célula en crecimiento o vegetativa. 

            Las esporas son resistentes a muchos agentes químicos y físicos. Hesiten dos tipos de esporas: Endosporas: espora presente en el interior de la bacteria. Destinada a germinar originando la forma vegetativa de la que deriva. Es un cuerpo de pared gruesa muy refringente y sumamente resistente. Son producidas por especies Bacillus, clostridium y Sporosarcina. Las endoesporas resisten las condiciones ambientales adversas de desecación, calor y mal suministro de nutrientes ( agentes químicos como desinfectantes) Exosporas : esporo que permanece libre en el ambiente, constituyendo la forma de resistencia bacteriana ante condiciones adversas o desfavorables (nutrición, desecación, temperatura, presencia de agentes químicos, presiones, etc.) 

PROCEDIMIENTO

A) TINCIÓN DE ESPORAS (TÉCNICA DE SHEAFFER Y FULTON)

1-Prepare un dos extendidos del microorganismo aislado del cultivo de microorganismo uno de Bacillus Suptillus y otro de Bacillus cereus

2-Fijar por calor y cubrir todo el portaobjeto con una solución de verde de Malaquita.

3-Calentar hasta emisión de vapores y seguir dicho calentamiento durante 3 minutos (no permitir que se seque el colorante. Si esto ocurriera, agregar colorante, sobre el preexistente y no sobre la parte seca, hasta cubrirlo nuevamente.)

4-Lavar con agua y cubrir con solución de Safranina. Dejar actuar 30 segundos. Lavar con agua, secar y observar con objetivo de inmersión.

5-Informar: morfología, color y tipo de espora.

El colorante Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente. La Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas. Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua, y sí lo harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo colorante

 TINCIÓN DE ESPORAS (TÉCNICA DE COLORACIÓN DE GRAM)

1.- Hacer un frotis de B. suptilis de la forma usual y otra de B. cereus

2.- Teñir con la coloración de Gram

3.-Observar al microscopio con el objetivo de inmersión

las esporas se pueden observar sin teñir o si se encuentra dentro del bacilo, la espora no se tiñe y el citoplasma se ve de color morado.

CUESTIONARIO

1.- Menciona dos funciones que tiene la pared celular en las bacterias

•    En Evitar la ruptura de las células bacteriana

•    Contribuye al mantenimiento de la forma de una bacteria y sirve como sitio de anclaje para los flagelos.

2.- ¿Cuáles son los principales compuestos orgánicos de las paredes celulares?

Está compuesto por peptidoglucano también conocido como mureina, que puede ser una estructura solitaria o están combinadas con otras sustancias. El peptidoglucano está compuesto por polisacáridos denominados acetiglucosamida (NAG) y acido N-acetilmuramico (NAM).

3. ¿Qué característica y que color tiñeron   las paredes celulares de las bacterias que lograste observar?

las bacterias Gram positivas están compuesta por varias capas de peptidoglucano que conforman una estructura gruesa y rígida. La pared celular de las bacterias gramnegativos contiene solamente una capa delgada de peptidoglucano. Las bacterias Gram positivas retienen el colorante cristal violeta y se tiñen de color violeta oscuro o purpura. Las bacterias Gram negativas pierden este color y aceptan el colorante de contraste safranina para teñirse de color rosa.

4.- Investiga las diferencias de la pared celular de las bacterias Gram positivas y Gram negativas

las diferencias de las paredes celulares de la bacteria Gram positivas y Gram negativas

• Las bacterias Gram positivas son diferente de la bacteria gramnegativo para las propiedades de tinción.

• Los modelos de envoltura celular de bacterias Gram positivas y Gram negativas se diferencian en presencia de ácidos teitoicos unidos al peptidoglicano en Gram positivas.

5.- Describe dos diferencias   para distinguir a una endospora de una exospora

Diferencias entre una endospora de una exospora:

• Las endospora se encuentran en el interior de la bacteria, a diferencia de la exospora permanece libre en el ambiente.

• Las endospora resisten condiciones adversas de mal suministro de nutrientes y a las altas temperaturas, a diferencia de la exospora son adversas a falta de nutrición y son desfavorables a alta temperatura.

6. ¿Qué característica y que color tiñeron las esporas observadas en las distintas muestras microbiológicas?

Las esporas sometidas correctamente a este método, resistirán la sustitución por el colorante de contraste y a menudo de podrían observar verde dentro de células rojas.

7. Menciona algunos microorganismos capaces de producir esporas

Alguno microorganismo capaces de producir esporas

•   Bacillus clostridium, provoca carbunco e intoxicación alimentaria.

•   Coexiella burnetii, bacteria Gram negativa que causa la fiebre

OBSERVACIONES

Dibuja las estructuras celulares que lograste observar con el objetivo de inmersión. 

 

 

CONCLUSIONES

En este experimento se utilizó una tinción simple debido a que la misma permite que se coloree toda la célula excepto la espora que se observa de un tamaño bien acepta

Las tinciones selectivas son aquéllas que permiten observar una estructura celular determinada, algunas bacterias tienen la capacidad de producir endosporas o producir ex polisacáridos conocidos como cápsulas. Las endosporas bacterianas estructuras de resistencia que se caracterizan por presentar varias capas compuestas de proteínas y azúcares complejos, mientras que en el protoplasto de la misma existe un complejo de dipicolinato de calcio, debido a esta composición, es muy difícil que los colorantes penetren, por lo que, al aplicar una tinción simple, estas aparecen como cuerpos incoloros (dentro o fuera de la célula).